《食品科学》：河南科技大学王耀、陈秀金副教授等：马拉硫磷的纳米金适配体比色传感检测的新方法

  马拉硫磷是果蔬种植过程中常用的杀虫剂，也常作为谷物储藏的保护剂。马拉硫磷虽属于低毒性化合物，但长期不合理的使用会导致环境及食品中马拉硫磷残留量超标，经食物链的富集进入人体内，通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性，造成肝脏以及中枢神经系统受损，严重的可导致中毒死亡。马拉硫磷残留的传统及快速检测方法均存在很多问题。适配体是通过体外筛选技术-指数富集配体系统进化技术（SELEX），从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的一种能特异结合待测靶标（如蛋白质或其他的小分子物质）的单链核苷酸，具有易合成、可修饰性强、结构相对比较简单、性质稳定等优势。

  河南科技大学食品与生物工程学院的田恒旗、王耀*、陈秀金*等人以马拉硫磷特异性适配体作为识别元件、基于纳米金（AuNPs）作为颜色指示剂，建立了马拉硫磷的适配体比色传感检测的新方法。本方法原理如图1所示，AuNPs是稳定的胶体溶液，在高盐环境下AuNPs会发生聚集，颜色和紫外吸收光谱会发生明显的变化，若在体系中加入适配体，通过静电吸附作用，适配体会结合到AuNPs表面，保护AuNPs在溶液中保持分散状态，不发生聚集，体系颜色也不发生明显的变化，当加入马拉硫磷后，适配体与马拉硫磷的高亲和力使得适配体会优先与马拉硫磷结合，AuNPs失去了适配体的保护，在高盐浓度下会发生聚集，溶液的颜色由红色逐渐变为蓝紫色，颜色的变化程度与添加的马拉硫磷质量浓度呈正相关。

  制备的AuNPs为颜色鲜艳的酒红色胶体溶液，紫外表征发现其特征吸收峰在518 nm波长处，峰形较为尖锐（图2），这表明制备的AuNPs粒径均一，具备比较好的性能。用透射电镜对制备的AuNPs的外观形貌进行表征（图3），能够准确的看出AuNPs呈现统一的圆球形，粒径较为均一，约为10 nm。正常情况下为分散状态（图3A），而在加入NaCl溶液后会发生聚集（图3B）。综上所述，本研究合成的AuNPs在水中呈现胶体状，具有均有的大小和形状，分散性良好，性质稳定。

  AuNPs是整个检测体系的颜色指示剂，其体积在整个反应体系中的占比直接影响方法的灵敏度，为获得裸眼观察的最佳指示颜色深度，通过向溶液中加入30 μL的马拉硫磷适配体溶液、马拉硫磷标准品溶液和500 mmol/L NaCl溶液，优化AuNPs在整个反应体积中的占比（40.0%、50.0%、62.5%、70.0%），结果见图4，当AuNPs体积分数为40%、50%和62.5%时，体系可以由红色变蓝色，但是体积分数为40%和50%时，颜色变化不明显，体积分数为62.5%时，颜色变化较为显著。因此选择AuNPs的体积分数为62.5%，即加入150 μL AuNPs溶液。

  AuNPs会在高盐环境下发生聚集，随着NaCl浓度的增加，AuNPs的聚集程度也随之增加，AuNPs的颜色发生明显变化，由酒红色逐渐变为蓝紫色。当NaCl浓度过大时，在没有靶标的情况下AuNPs也有几率发生聚集；当NaCl浓度过小时，AuNPs可能只发生部分聚集进而影响试验的结果，因此本研究对NaCl浓度来优化。在AuNPs的最佳反应体积下（150 μL），用超纯水代替适配体和靶标，然后加入30 μL不同浓度（0、50、200、350、500、650、800、950 mmol/L）的NaCl溶液，充分混匀，静置10 min后观察溶液的颜色并使用紫外分光光度计进行吸光度的测定。

  如图5所示，当NaCl浓度低于500 mmol/L时，AuNPs呈红色，表明此时的NaCl浓度较低，无法使AuNPs发生聚集；当NaCl浓度为500 mmol/L时，AuNPs发生聚集，颜色由红色变为蓝色。之后随着NaCl浓度的继续增加，AuNPs的颜色不再发生明显变化。但是单以颜色变化不能够准确判定出AuNPs聚集完成情况，应该要依据紫外吸收光谱的变化进行判定。由图5能够准确的看出，随着NaCl浓度增加，AuNPs在518 nm波长处的吸收峰值逐渐变小，并且在620 nm波长处出现了一个新的特征吸收峰，是因为AuNPs发生聚集导致等离子发生了共振变化，使得AuNPs的特征吸收峰向右发生了偏移。因此，应该要依据A620 nm/A518 nm值判定AuNPs的聚集程度，结果如图6所示，当NaCl浓度为500 mmol/L时，A620 nm/A518 nm值突然增大，之后随着NaCl浓度的继续增加，不再发生明显变化，因此NaCl的最佳浓度为500 mmol/L。

  当AuNPs溶液中不存在适配体时，AuNPs在高盐环境下会发生聚集，AuNPs由红色变为蓝紫色；当加入的适配体浓度较低时，通过静电吸附作用，低浓度的适配体可以吸附在AuNPs表面，但因为浓度较低，不能够将AuNPs的表面完全包裹，仍然有一部分AuNPs呈单一分散状态，此时AuNPs溶液会由蓝色变为蓝紫色；当适配体浓度为1 μmol/L时，适配体可保护AuNPs不发生聚集现象，此时AuNPs溶液呈现酒红色，之后随着适配体浓度的继续增加，不再发生明显变化。如图7所示，当适配体浓度为1 μmol/L时，A 620 nm /A 518 nm 值也不再随着适配体浓度的增加而改变，说明在500 mmol/L的NaCl浓度下，1 μmol/L的适配体已经将AuNPs的表面完全包裹，使其结构更稳定，不再受高NaCl浓度的影响发生聚集现象。

  AuNPs在高浓度NaCl溶液中的聚集需要一段时间，在达到稳定状态之前，颜色会不断发生明显的变化，与之相应的A 518 nm 也会不断发生明显的变化。为了使检测更为准确，减小误差，需要研究体系颜色从不断发生明显的变化到达到稳定状态所需要的时间。如图8所示，当NaCl浓度为500 mmol/L时，A 518 nm 在10 min之前，随着反应时间的延长吸光度不断降低；而在10 min后，随着反应时间延长，吸光度不再发生明显变化。因此，AuNPs与500 mmol/L的NaCl溶液的最佳反应时间为10 min。

  如图9所示，随着AuNPs与适配体孵育时间延长，A 518 nm 也随之增加，在10 min时吸光度达到最大。然后跟着时间延长，吸光度慢慢的出现一段下降趋势。这表明时间比较短时，适配体还没有完全吸附在AuNPs的表面，存在一部分分散的AuNPs；适配体作为单链DNA序列，反应时间过长时，序列的质量在室温下会会降低，有几率会使部分AuNPs不再处于聚集状态。综上所述，AuNPs与适配体的最优反应时间为10 min。

  在最佳的条件下，建立了AuNPs-适配体比色传感法定量检测马拉硫磷的方法，为减弱基质效应影响，采用与实际样品相同的加标条件绘制了基质标准曲线所示，随着马拉硫磷质量浓度升高，溶液颜色逐渐由红变蓝，在马拉硫磷质量浓度范围为50～1 500 ng/mL时，A 620 nm /A 518 nm 值与马拉硫磷质量浓度呈线.995，检出限为45.54 ng/mL。在马拉硫磷质量浓度为300 ng/mL时，AuNPs慢慢的开始变色，为防止视觉误差，马拉硫磷目测检出限为400 ng/mL。本方法与其他检测的新方法的比较如表1所示，国标中规定的生菜和苹果中马拉硫磷的最大残留限量最低为500 ng/mL，本方法的检出限远低于国标限量，且在较大的线性范围内均适用。

  本研究选择马拉硫磷、乐果、乙酰甲胺磷、毒死蜱、敌敌畏、草甘膦、吡虫啉、倍硫磷考察方法的特异性，如图11所示，在体系中加入800 ng/mL的马拉硫磷、乐果、乙酰甲胺磷、毒死蜱、敌敌畏、草甘膦、吡虫啉、倍硫磷，除马拉硫磷外，加入其他农药时A 620 nm /A 518 nm 值较低，与阴性对照大致相同，AuNPs不发生聚集；而加入马拉硫磷时，体系中A 620 nm /A 518 nm 值较大，AuNPs发生聚集现象。表明本方法对马拉硫磷具有特异性识别能力，且马拉硫磷结构类似物及其他有机磷农药不会影响马拉硫磷残留的特异性检测。

  为验证建立的AuNPs-适配体比色传感法的准确性和可靠性，采用本方法对生菜和苹果样品进行仔细的检测。从本地超市购得生菜和苹果样品中未检出马拉硫磷。通过向预处理的样品中添加马拉硫磷标准品制作而成不同质量浓度（200、400、800 ng/mL）的加标检测液。使用本办法来进行检测，每个样品重复测定3 次。如表2所示，基于AuNPs-适配体的比色传感法检测马拉硫磷的加标回收率范围分别为98.24%～100.91%和99.48%～101.29%，相对标准偏差分别为0.2%～2.2%和0.2%～2.8%。上述根据结果得出，基于适配体建立的AuNPs-适配体比色传感法拥有非常良好的准确性和可靠性。本方法可用于生菜和苹果中马拉硫磷的快速筛查和现场检测。

  国标法检测结果如表3所示，将本方法的检测结果与国标法的结果作对比（图12），结果显示两者的准确度一致，生菜样品和苹果样品的R 2 均为0.999，证实了本方法的可靠性。

  以AuNPs为指示剂，马拉硫磷适配体作为识别元件，建立了AuNPs-适配体比色传感法。通过优化溶液浓度，最后得到NaCl最适浓度为500 mmol/L，适配体浓度为1 μmol/L。通过优化孵育时间，最终得到的NaCl与AuNPs最佳反应时间为10 min，马拉硫磷适配体与AuNPs最佳反应时间为10 min。本方法在马拉硫磷质量浓度为50～1 500 ng/mL范围内呈现良好的线，根据计算得到本方法检出限为45.54 ng/mL，

  目测检出限为400 ng/mL。本方法简单快速，易于进行定性和定量分析，具备优秀能力的灵敏性、特异性和准确性。经验证，本方法在实际加标样品中的检测结果与国标法的检测结果高度一致，是一种可行的快速检测食品中马拉硫磷残留的高效方法，可为其他农药的现场快速筛查方法研究提供参考。

  本文《马拉硫磷的纳米金适配体比色传感检测的新方法》来源于《食品科学》2023年44卷第18期324-330页，作者：田恒旗，王耀，杨海涛，李兆周，吴佳蓓，王琳，刘浩宇，常云鹤，陈秀金。DOI:10.7506/spkx0915-142。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

  实习编辑：渤海大学食品科学与工程学院 王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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